国产多孔钽对MG63细胞中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2和钙结合蛋白A4表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1626

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (10): 1546-1551.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1626

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国产多孔钽对MG63细胞中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2和钙结合蛋白A4表达的影响

陈婧婧¹，王茜¹，崔逸爽¹，滕雪峰¹，张辉²，李琪佳^1，3

华北理工大学，¹医学实验研究中心，³基础医学院，河北省唐山市 063210；²唐山市第二医院关节一科，河北省唐山市 063000

收稿日期:2018-11-12 出版日期:2019-04-08 发布日期:2019-04-08
通讯作者: 李琪佳，教授，主任医师，硕士生导师，华北理工大学医学实验研究中心，河北省唐山市 063210
作者简介:陈婧婧，女，1990年生，山东省潍坊市人，汉族，华北理工大学在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家科技部科技支撑课题资助项目(2012BAE06B03)；河北省科技支撑资助项目(16277776D)，项目负责人：李琪佳；河北省医学科学研究重点课题计划资助项目(20160225)；华北理工大学博士科研启动基金资助项目(28606299)，项目负责人：王茜；河北省卫计委资助课题(20180733)，项目负责人：王茜

Effects of domestic porous tantalum on expression of collagen type I, tissue transglutaminase 2 and calcium-binding protein A4 in MG63 cells

Chen Jingjing¹, Wang Qian¹, Cui Yishuang¹, Teng Xuefeng¹, Zhang Hui², Li Qijia^{1, 3}

¹Medical Research Center,³School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, Hebei Province, China; ²First Department of Joint, Second Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2018-11-12 Online:2019-04-08 Published:2019-04-08
Contact: Li Qijia, Professor, Chief physician, Master supervisor, Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, Hebei Province, China; First Department of Joint, Second Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Chen Jingjing, Master candidate, Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063210, Hebei Province, China
Supported by:
the Project supported by the Ministry of Science and Technology of China, No. 2012BAE06B03; Hebei Province Science and Technology Support Project, No. 16277776D (to LQJ); Hebei Provincial Medical Research Project, No. 20160225; the Project Supported by the Foundation of Doctoral Research of North China University of Science and Technology, No. 28606299 (to WQ); the Project Supported by Hebei Provincial Health and Family Planning Commission, No. 20180733 (to WQ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
国产多孔钽：具有自主知识产权，具有立体三维空间构型，具有与人体骨组织相近的力学强度、弹性模量，具有良好的生物相容性及骨传导能力。在植入时可使其周围骨组织黏附并向孔隙内生长，正逐渐替代自体骨、同种异体骨、金属钛和不锈钢等传统医用生物材料，成为骨缺损修复的新型修复材料。
多孔钽成骨机制：国产多孔钽与MG63细胞体外复合培养后，细胞与多孔钽接触并在其表面及孔隙中黏附生长，与周围相邻细胞连接、融合，细胞增殖及分化，同时Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2呈高表达。证实国产多孔钽可增强成骨细胞黏附性，进一步促进细胞的增殖和矿化；而钙结合蛋白A4呈低表达，提示此时细胞分化作用加强，利于新骨成熟。
MG63细胞：为人成骨肉瘤细胞，细胞形态呈成纤维细胞样，贴壁生长，该细胞源自14岁患有骨肉瘤的白人男性，该细胞表达转化生长因子β受体Ⅰ和Ⅱ。

背景：目前有证据已证实国产多孔钽具有良好的生物相容性及促成骨性能，但具体的成骨机制及对成骨因子的影响尚不明确。
目的：观察国产多孔钽材料对MG63细胞Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2及钙结合蛋白A4表达的影响。
方法：将对数生长期的MG63细胞接种于24孔板，分3组培养：空白组加入常规培养基，钽浸提液组加入多孔钽材料浸提液，钽支架组加入多孔钽材料与常规培养基。培养第1，3，5，7，9天，CCK-8法检测各组细胞增殖；培养第5天，采用ELISA酶联免疫吸附法检测各组细胞分泌Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2和钙结合蛋白A4的水平，Western-blot法检测各组细胞中钙结合蛋白A4、Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2蛋白的表达。
结果与结论：①随着培养时间的延长，各组细胞数量呈逐渐增加趋势，3组不同时间点的细胞增殖比较无差异(P > 0.05)；②钽支架组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2分泌高于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)，钽浸提液组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2分泌高于空白组(P < 0.05)；钽支架组钙结合蛋白A4分泌低于其他两组(P < 0.05)；③钽支架组中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2蛋白表达均高于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)，钽浸提液组中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2蛋白表达高于空白组(P < 0.05)；钽支架组钙结合蛋白A4蛋白表达均低于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)；④结果表明，国产多孔钽材料可促进MG63细胞分泌Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2，抑制其分泌钙结合蛋白A4。

ORCID: 0000-0001-9890-7177(陈婧婧)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 国产多孔钽, MG63细胞, Ⅰ型胶原, 谷氨酰转氨酶2, 钙结合蛋白A4, 钽浸提液

Abstract:

BACKGROUND: At present, there is evidence that domestic porous tantalum has good biocompatibility and osteogenic properties, but the specific osteogenic mechanism and its effect on osteogenic factors are still unclear.

OBJECTIVE: To observe the effects of domestic porous tantalum materials on the expression of collagen type I, tissue transglutaminase-2 and calcium-binding protein A4 in MG63 cells.

METHODS: MG63 cells in logarithmic growth phase were inoculated onto 24-well plates and cultured in three groups: in blank group, conventional medium was added; in tantalum extract group, porous tantalum material extract was added; and in tantalum scaffold group, porous tantalum material and conventional medium were added. On 1, 3, 5, 7 and 9 days of culture, the cell proliferation of each group was detected by cell counting kit-8 method. On 5 days of culture, the levels of collagen type I, tissue transglutaminase-2 and calcium-binding protein A4 secreted by MG63 cells in each group were detected by ELISA. Western blot assay was used to detect the expression of three proteins in each group.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the prolongation of culture time, the number of cells in each group increased gradually. There was no difference in cell proliferation among the three groups at different time points (P > 0.05). (2) The secretory levels of collagen type I and tissue transglutaminase-2 in the tantalum scaffold group were significantly higher than those in the blank group and tantalum extract group (P < 0.05), while the secretion of collagen type I and tissue transglutaminase-2 in the tantalum extract group was significantly higher than that in the blank group (P < 0.05). The secretion of calcium-binding protein A4 in the tantalum scaffold group was significantly lower than that in the other two groups (P < 0.05). (3) The expression of collagen type I and tissue transglutaminase-2 protein in the tantalum scaffold group was significantly higher than that in the blank group and tantalum extract group (P < 0.05), while the expression of collagen type I and tissue transglutaminase-2 protein in the tantalum extract group was significantly higher than that in the blank group (P < 0.05). The expression of calcium-binding protein A4 in the tantalum scaffold group was significantly lower than that in the blank group and tantalum extract group (P < 0.05). To conclude, domestic porous tantalum materials could promote the secretion of collagen type I and tissue transglutaminase-2 by MG63 cells, and inhibit the secretion of calcium-binding protein A4.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tantalum;, Collagen Type I, Calcium-Binding Proteins;, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

R318.08

陈婧婧, 王茜, 崔逸爽, 滕雪峰, 张辉, 李琪佳. 国产多孔钽对MG63细胞中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2和钙结合蛋白A4表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(10): 1546-1551.

Chen Jingjing, Wang Qian, Cui Yishuang, Teng Xuefeng, Zhang Hui, Li Qijia. Effects of domestic porous tantalum on expression of collagen type I, tissue transglutaminase 2 and calcium-binding protein A4 in MG63 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(10): 1546-1551.

图/表（结果） 6

2.1 观察国产多孔钽材料多孔钽材料质地坚硬，呈深灰色，表面凹凸不平且有光泽，钽支架内外有均匀的海绵状小孔；扫描电镜镜下可见均匀分布的微孔结构，孔隙直径为400-600 μm，孔间相互联通，呈现三维空间结构；微孔内部有孔隙联络相通，孔隙直径为50-200 μm，孔隙空间小梁表面粗糙有光泽，与人松质骨结构相似，见图1。

2.2 MG63细胞形态观察培养至第5天，倒置相差显微镜观下可见：空白组、钽浸提液组细胞贴壁生长，呈长梭形，可见伪足形成的突起，突起之间部分有交汇，细胞密度约为80%，细胞形态清晰；钽支架组细胞在多孔钽表面及周围生长，见图2。

2.3 CCK-8法检测细胞增殖细胞增殖情况，见表1，图3。相同时间点内，钽支架组与空白组、钽浸提液组细胞增殖相比差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 ELISA酶联免疫吸附法检测相关因子水平培养第5天，钽支架组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2分泌水平高于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)，钽浸提液组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2分泌水平高于空白组(P < 0.05)，钽支架组中钙结合蛋白A4分泌水平低于其他两组(P < 0.05)，见表2。

2.5 Western-blot法检测相关蛋白表达使用Image对各个图片进行分析，结果显示：钽支架组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2蛋白表达高于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)，钽浸提液组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2蛋白表达高于空白组(P < 0.05)；钽支架组钙结合蛋白A4表达低于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)，见图4。

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引言

临床中，严重创伤、肿瘤切除及大节段性骨缺损是骨科面临的主要挑战，骨缺损造成的功能丧失严重影响了患者生活质量^[1-2]。骨移植是治疗骨缺损的必要手段，骨移植主要包括自体骨移植和同种异体骨移植。自体骨移植是“金标准”^[3]，但自体骨来源局限，大范围骨缺损无法使用。同种异体骨移植避免了取材量少的问题，但存在免疫排斥反应和传播疾病的危险^[4]。组织工程支架材料是治疗骨缺损的重要方法。金属钽支架用于临床已有半个多世纪的历史^[5]。多孔钽金属支架弹性模量低、耐腐蚀性强^[6]、表面摩擦特性高，骨结合性能(生物活性、生物相容性和生长性能)优异^[7]，其三维立体空间利于与骨结合^[8-9]，是理想的骨移植材料。

目前，国外Zimmer公司采用气相沉积法制备了多孔钽金属，其具有三维空间立体结构^[10-11]，但成本较高、价格昂贵。重庆润泽医疗器械有限公司与国内多家单位合作，采用海绵浸渍-高温烧结技术研发出国产多孔钽支架材料，其孔径可达400-600 μm，孔隙率在75%-85%之间，与人骨孔隙率(70%-90%)十分接近，同时孔壁小梁上具有微孔结构，微孔之间纵横交错形成相互连通的网格，为成骨细胞的增殖、分泌提供广阔的空间^[12]。

现有研究发现，国产多孔钽具有良好的生物相容性及促成骨作用，在骨缺损修复中可通过影响成骨因子的表达促进成骨^[13]，但对一些因子的影响尚不明确。Ⅰ型胶原是骨组织重要的细胞外基质，与成骨细胞的生长、分化，与骨重建关系密切^[14-15]。谷氨酰转氨酶A2作为多功能的酶，在骨形成中也发挥重要作用^[16]。钙结合蛋白A4参与成骨细胞的分化^[17]。国产多孔钽与细胞复合培养后是否会影响以上因子的表达尚不明确。为此，实验观察与国产多孔钽复合培养后，MG63细胞Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2、钙结合蛋白A4的表达变化，探讨国产多孔钽促成骨作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2017年10月至2018年5月在华北理工大学医学实验研究中心、华北理工大学基础医学院、河北省慢性疾病重点实验室、唐山市慢性病临床基础研究重点实验室完成。

1.3 材料直径1.5 cm、厚度0.2 cm的片状多孔钽材料(重庆润泽医疗器械有限公司)；MG63细胞(北京协和细胞库)；MEM培养液(北京中生奥邦生物科技有限公司)；胰蛋白酶(Biological Industries公司，以色列)；胎牛血清(Gemini，美国)；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒(广州奕源生物技术有限公司)；人Ⅰ型胶原酶联免疫分析试剂盒、人谷氨酰转氨酶A2酶联免疫分析试剂盒及人钙结合蛋白A4酶联免疫分析试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司)；兔抗人型胶原多克隆抗体(Abgent，美国)；兔抗人谷氨酰转氨酶A2多克隆抗体(GeneTex，美国)；兔抗人钙结合蛋白A4多克隆抗体(Arigo Biolaboratories，美国)；FITC 标记的山羊抗兔IgG二抗(Seracare，美国)；预染蛋白 Marker、超敏 ExPlus ECL 化学发光检测试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；二氧化碳培养箱(Esco，美国)；倒置相差显微镜(Olympus 公司，日本)；酶标仪(BIO RAD company，美国)；免疫印迹电泳槽、免疫印迹电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 多孔钽材料制备将多孔钽材料浸入无水乙醇中脱脂15 min，超声波清洗器纯水清洗3次，10 min/次，干燥箱烘干后高压蒸汽法高压灭菌，待用。

1.4.2 多孔钽材料浸提液制备依据ISO10993-12制备钽浸提液。浸提介质为含体积分数10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%双抗的MEM培养基。将多孔钽材料置于含体积分数10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%双抗的MEM培养基中，多孔钽材料与浸提介质比例为0.2 g/mL，在37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养72 h，使用0.22 μm滤器过滤钽粒和杂质，所得液体即为多孔钽材料浸提液。

1.4.3 细胞分组培养复苏MG63细胞后，加入常规培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养，隔天换液1次。取对数期生长细胞，生理盐水冲洗后，胰酶消化、离心，加入培养基，制备细胞混悬液并进行计数，按5×10⁴/孔接种于24孔板中，分为3组：空白组加入常规培养基，钽浸提液组加入多孔钽材料浸提液，钽支架组加入多孔钽材料与常规培养基。常规培养基为含体积分数10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%双抗的MEM培养基。

1.5 主要观察指标

CCK-8法检测细胞增殖：培养1，3，5，7，9 d，每组取6孔吸尽培养液，加入相应的500 μL新培养基，并加入50 μL CCK-8溶液，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养2 h后，吸取各组24孔板中的上清100 μL，依次加入96孔板中，酶标仪测定吸光度值，并绘制细胞增殖曲线。

ELISA酶联免疫吸附法检测相关因子分泌：培养第5天，收集各组中细胞培养基上清，3 000 r/min离心20 min，吸取上清依次移入EP管中。按ELISA酶联免疫分析试剂盒说明书操作，分别检测各组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2和钙结合蛋白A4的吸光度值，制作标准曲线并计算出相应的浓度。

Western-blot法检测相关蛋白表达：培养第5天，收集各组细胞，RIPA裂解液裂解细胞，提取蛋白并定量，用RIPA裂解液将待测蛋白浓度调至一致，按4∶1的比例将蛋白与5×蛋白上样缓冲液混匀，100 ℃变性5 min。取等量蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后采用湿转的方法将蛋白转移至PVDF膜上，10%脱脂奶粉4 ℃摇床封闭30 min，1×TBST清洗10 min，加入蛋白相应的一抗，4 ℃孵育过夜，1×TBST洗涤3次，10 min/次，FITC 标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室温孵育1 h；1×TBST洗涤3次，按超敏ExPlus ECL化学发光检测试剂盒说明书配制显色液进行显色，采用Image J图像分析软件进行分析。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件分析实验数据，计量资料数据以x(_)±s表示，采用单因素方差分析检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨缺损是临床常见疾病，中国每年有超过百万患者需要进行骨缺损修复治疗，虽然自体骨移植是“金标准”，但自体骨量有限。异体骨存在免疫反应，使得骨移植受限。因此，支架材料成为人们研究的焦点。理想的骨移植材料需具备合适的孔隙率、高摩擦系数、与骨类似的弹性模量，以利于骨内向生长、材料-骨界面固定，减少应力遮挡效应^[18-19]。多孔钽支架材料具备高孔隙率(65%-80%)^[20]、低弹性模量(373 MPa至2.2 GPa)和高摩擦特性^[21-22]，以及类似松质骨的微结构(直径400-600 μm)，有利于新骨的形成。多孔钽在骨缺损、关节置换等手术中显现出良好的早期临床效果^[23-25]，已被应用于牙科^[26]、骨科及口腔颌面部重建^[27-28]。

目前临床上广泛应用的是美国Zimmer公司生产的多孔钽产品，其成本较高、价格昂贵。重庆润泽医疗器械有限公司与国内多家单位合作，研发出国产多孔钽支架材料，其具备良好的生物相容性及成骨学性能，但具体成骨机制尚不明确。Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2在成骨细胞的生长及骨重建中发挥重要作用^[16-17]。钙结合蛋白A4参与成骨分化，在骨形成中发挥重要作用。

国产多孔钽与细胞复合培养后，是否可能通过影响以上因子的表达进而促进成骨尚不明确。为此，研究将MG63细胞与国产多孔钽复合培养，采用CCK-8法检测细胞增殖活性，ELISA酶联免疫吸附法及Western-blot法检测Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2和钙结合蛋白A4的表达变化。

CCK-8检测发现，钽支架组、钽浸提液组细胞增殖与空白组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，提示国产多孔钽与多孔钽浸提液对MG63细胞增殖影响不大，无细胞毒性。MG63细胞与国产多孔钽复合培养，通过ELISA酶联免疫吸附法和Western-blot法检测MG63细胞Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2的表达情况，发现钽支架组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2的表达高于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)，提示国产多孔钽特有的三维空间微孔结构可能促进Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2的表达，影响细胞的黏附功能。谷氨酰转氨酶A2调节细胞-基质相互作用、组织稳定性和多种其他细胞功能，确保细胞黏附、存活和增殖^[29]；Ⅰ型胶原可形成骨骼与结缔组织，保持骨架的完整性^[30]，并参与成骨细胞的增殖、分化，与成骨密切相关^[31]。有研究证明，Ⅰ型胶原与谷氨酰转氨酶A2交联可提高细胞的黏附、分化效率。此次研究发现，钽浸提液组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2表达高于空白组(P < 0.05)，提示钽金属可能促进细胞中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2的表达，提高细胞的黏附；钽支架组Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2表达高于空白组、钽浸提液组(P < 0.05)，提示国产多孔钽可能比钽浸提液更能促进谷氨酰转氨酶A2和Ⅰ型胶原的相互作用。多孔钽纵横交错、相互连通的网格结构，有利于营养物质的传输，并为细胞和组织的长入提供空间。Ⅰ型胶原可增强基质金属蛋白酶1抗蛋白质降解作用和细胞分泌蛋白酶的总补体抗性^[32]，进而提高蛋白水解抗性，增加细胞接触时间，为细胞的分化提供所需的整合素介导信号，提高细胞的黏附、铺展和分化效率。国产多孔钽的三维立体结构优于钽浸提液的二维平面结构，更有利于提高细胞的黏附功能。

此外，实验通过ELISA法和Western-blot法检测发现，钽支架组中钙结合蛋白A4表达低于空白组、钽浸提液组 (P < 0.05)。有研究证实，钙结合蛋白A4对成骨细胞的基质矿化具有负调节作用。钙结合蛋白A4 mRNA主要在前成骨细胞培养的早期阶段表达。然而，当细胞成为成熟的成骨细胞并出现矿化结节时，钙结合蛋白A4表达不存在^[33]。此次实验中，ELISA法和Western-blot法检测到钽浸提液组与空白组钙结合蛋白A4相比无差异(P > 0.05)，推测钽金属可能对钙结合蛋白A4影响不大；钽支架组钙结合蛋白A4表达较空白组、钽浸提液组均少(P < 0.05)，提示国产多孔钽的三维立体结构，可能是抑制钙结合蛋白A4表达的主要因素，国产多孔钽的三维立体结构为细胞获取营养、排除废料及形成骨基质提供充足的空间，细胞黏附性增强，促进细胞进一步的增殖和矿化基质的产生。钙结合蛋白A4表达减少，促进细胞分化，成骨细胞向骨细胞转变，有利于成骨。据报道，谷氨酰转氨酶A2和钙结合蛋白A4之间相互作用，钙结合蛋白A4作为TG2的底物，促进细胞迁移^[34]。国产多孔钽材料通过谷氨酰转氨酶A2和钙结合蛋白A4影响细胞迁移的作用机制尚未明确，需进一步探究。

综上所述，国产多孔钽与MG63细胞体外复合培养后，细胞增殖状态良好，证实国产多孔钽具备良好的生物相容性；Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶A2表达增高，钙结合蛋白A4表达减少，提示国产多孔钽的三维立体结构有利于细胞的黏附、迁移和矿化，具有良好的促成骨作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

国产多孔钽对MG63细胞中Ⅰ型胶原、谷氨酰转氨酶2和钙结合蛋白A4表达的影响

Effects of domestic porous tantalum on expression of collagen type I, tissue transglutaminase 2 and calcium-binding protein A4 in MG63 cells

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